（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

多個生物標志物的實時同步成像不僅為研究生物體內(nèi)某一病理通路內(nèi)不同生物標志物之間的基本相關(guān)性提供了獨特的機會，而且提高了疾病診斷的準確性。可激活的熒光探針因其對目標生物標志物具有較高的敏感性和特異性，已成為醫(yī)學上有價值的工具。然而，目前用于雙生物標志物成像的研究還很少，更不用說多生物標志物成像了。由于這些探針通常依賴于兩種熒光分子的各自激活導致發(fā)射光譜重疊而常常發(fā)生信號串擾，這可能會影響生物標志物的分辨率。與熒光探針相比，化學發(fā)光(CHL)探針由于消除了實時光激發(fā)，使得背景噪聲最小。然而，大多數(shù)CHL底物在生理條件下都有微弱的發(fā)光。

為改善化學發(fā)光和熒光在雙生物標志物成像的不足，南洋理工大學浦侃裔課題組合成了雙生物標志物成像的單分子化學/熒光報告劑（CFR）。CFR可以用于DIH成像。由于氧化應激和細胞凋亡在炎癥反應和肝功能衰竭出現(xiàn)之前的DIH早期就被發(fā)現(xiàn)上調(diào)，因此選擇O₂^??和casp3作為CFR設(shè)計的早期生物標志物。CFR是第一種具有兩個獨立激活通道的光學小分子探針：用于檢測casp3的近紅外通道(NIRF)；用于檢測O₂^??化學發(fā)光通道（CHL）。NIRF部分是通過修飾半花菁的羥基實現(xiàn)的。能被casp3切除的多肽[Asp-Glu-Val-Asp]通過可自消除的連接基團修飾到半花菁上。CHL部分是通過可以被O₂^??切除的三氟甲基磺酸（Tf）修飾的苯酚實現(xiàn)的。casp3的存在導致肽段與CFR的自消除連接基團之間的酰胺鍵斷裂，然后通過1,6-消除自發(fā)生成半花菁，產(chǎn)生熒光。與產(chǎn)生熒光信號不同的是，化學發(fā)光信號是O₂^??攻擊CFR的磺酸酯產(chǎn)生的。O₂^??攻擊CFR的磺酸酯后，誘導Tf基團去保護，產(chǎn)生高度不穩(wěn)定的苯酚-二氧乙烯衍生物。苯酚-二氧乙烯衍生物是一個中間產(chǎn)物，這個中間產(chǎn)物經(jīng)歷了自發(fā)的分解，并釋放出光子，產(chǎn)生CFL信號。

為了研究CFR的光學性質(zhì)和傳感能力，南洋理工大學浦侃裔教授課題組研究了在沒有或同時存在這兩種生物標志物的條件下 CFR的吸收光譜、NIRF光譜和CHL光譜的情況。

 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

CFR在610 nm和660 nm處具有最大紫外吸收峰，幾乎沒有熒光或化學發(fā)CFR與casp3孵育后，由于肽段的裂解和半花菁的生成，CFR在690 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，而HPLC證實了半花菁的生成。casp3對肽段的裂解使得NIRF在710 nm的熒光增強了12倍。在O₂^??存在的情況下，CHL信號在540 nm處被激活，此時CFR的吸收和NIRF的光譜性質(zhì)幾乎沒有改變。O₂^??誘導的的CHL是背景光的40000倍。這些數(shù)據(jù)表明，CFR分別通過NIRF和CHL的信號，靈敏特異的檢測casp3和O₂^??。

基于CFR光譜性質(zhì)的研究情況，他們將CFR用于小鼠肝細胞雙成像。用藥物丙戊酸（VPA）處理細胞，結(jié)果證實了CFR在活細胞中對casp3和O₂^??成像的可行性。

 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

隨后，他們在DIH小鼠模型上進一步研究CFR用于雙成像的能力。CFR的體內(nèi)雙信號演化趨勢與體外結(jié)果相似。用VPA處理的小鼠，線粒體功能混亂，隨后過度產(chǎn)生O₂^??。ROS水平升高會導致DNA損傷和線粒體通透性轉(zhuǎn)變，激活casp3。最后，細胞凋亡發(fā)生，導致細胞死亡和組織損傷。因此，CFR的雙信號演化和DIH的機理一致，這進一步證實CFR在發(fā)生DIH時可以縱向和差異地檢測到O₂^??和casp3的上調(diào)。

 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)：南洋理工大學浦侃裔教授課題組設(shè)計了一種雙模態(tài)成像探針CFR,并證實了該探針可用于DIH的早期診斷。該探針具有兩個獨立的光通路，可以互不干擾的對O₂^??和casp3靈敏特異的檢測。CFR對DIH的臨床前藥物篩選和臨床診斷具有重要的應用前景。CFR是第一種具有光激發(fā)和化學發(fā)光的雙成像小分子探針。這種CFR分子設(shè)計可以簡單地通過改變CHL和NIRF信號轉(zhuǎn)導位點上的 帽子基團，推廣到其他生物標志物的雙成像。

撰稿人：犟子柳